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生物數學 (2) 整合素與切神經關係的基礎論文
文章出處
  蔡豐州醫師
日期&閱覽
 張貼日期:2010/8/17  閱覽次數:2046
                               整合素與切神經關係的基礎論文

題目: Denervation Dynamically Regulates Integrin alpha-7 Signaling
Pathways and Microscopic Structures in Rats

發表期刊: J Trauma 2010
同時站長也受邀於國際會議 Aesthetic Asia 發表此創見
欲看全文可至我學術論文網站 www.bio-pattern.com

創新:
此論文是我論文架構的第2篇
 
  前述第一篇論文闡述了肉毒桿菌素與切神經的差異, 得知了去神經化存活與細胞凋亡訊息傳導分子動態時間變化是同時性與雙相性. 接著, 邏輯上, 我希望進一步找到組織表面某一原本就和 前述存活, 細胞凋亡功能息息相關, 具有可以啟動細胞內存活或細胞凋亡下游訊息傳導分子的蛋白; 同時這一表面蛋白也和環境(或是細胞外間質extracellular matrix (ECM))互動密切, 因為其位置在細胞表面, 除了探討此蛋白動態變化是否和表面構造複雜度變化有關聯之外, 也可以藉此表面蛋白 雙方向 (bidirectional), 內外溝通訊息傳導媒介的角色, 簡化細胞或組織複雜系統的分析, 也就是分析一表面關鍵蛋白, 即可以獲得多元訊息, 提供未來研究的方向與目的. 

  邏輯上, 此和細胞外間質密切互動相連的分子是細胞結合蛋白(cell adhesion molecules, CAMs)中的整合素(integrin). 細胞結合蛋白提供的是同種細胞間連接(homotypic types, 例如 cadherins) 或是 細胞和細胞間質 (heterotypic types, 例如 integrins) 連接的作用. 當然, 整合素似乎更符合本研究的研究標的: 雙方向訊息傳導媒介. 整合素是異雙聚合穿膜醣蛋白 (heterodimeric, transmembrane glycoproteins) 由alpha鏈 與 beta 鏈各一條組成.  截至目前為止, 共有18種alpha鏈 與 8種beta 鏈 被發現, 而這兩種鏈排列組合至少有 24 種不同的雙合物(dimers)被辨認出來. 其中, integrin alpha7 是骨骼肌最主要的整合素, 過去的研究發現, 它的位置都處於非常關鍵的地方 (如z-discs, intercalated discs, 以及costameres), 除了主要提供連接功能外, 更可以促進肌細胞增生, 存活, 並對抗細胞凋亡. 因此, 研究肌纖維表面的此一整合素可以和上一篇論文的存活, 細胞凋亡機轉連接, 也就是分析組織表面的整合素, 是否可以代表其連動的下游訊息傳導? 其他的整合素, 如 alpha3 或 alpha v,  則提供胚胎演化生成(embrogenesis)時, 肌纖維(myofibrils) 與肌質(sarcolemma)的連接.
 
  整合素位於細胞表面, 其本身下游訊息傳導分子Ras/Raf/ERK1/2, 也被納入本研究分析. 無論是 Ras 或是 Raf 所引發的後續訊息傳導路徑 都是扮演與獨立轉錄, 協調整合素活性的角色(transcription-independent modulator). 活化的Ras 可以和 Raf kinases高親和力結合在一起, 使得他們更容易轉進(translocation) 至細胞內 Raf 所需要活化反應的地方. 接下來, 整合素更下游的訊息傳導分子是MAPK (mitogen-activated protein kinases)這一族. MAPK 目前有三個子類 : extracellular signal-regulated kinase (ERK), c-Jun NH2-terminal kinase, 以及 p38 kinase (p38), 與整合素存活功能較有關的是ERK.
 
  另外, 本研究想要探討結構, 無論是肌肉表面或是內部, 在去神經化後的動態變化, 因此研究包括表面(SEM)與穿透電子顯微鏡(TEM)之外, 與構造相關的分子蛋白也納入分析. 我們知道肌纖維內部的收縮單位, 藉由myofilament (分成肌動蛋白(actin)與肌凝蛋白(myosin))的交互滑動, 來產生肌肉收縮的力量. 不同的肌肉, 其組成肌蛋白的isoform也有所不同. 去神經化之後, 會讓myofilament 組成比例改變, 譬如: 去神經化之後, 肌凝蛋白重鏈(MHC, myosin heavy chain)堛熔釵hisoform中會減少的, 在慢肌是MHC type I, 快肌則是 type IIB; 但是, 這兩種不同的肌肉MHC type IIA 卻都會增加. 上一篇論文藉由穿透電子顯微鏡(TEM)已經發現, 去神經化會改變內部收縮單位的排列, 因此我們再深入探討肌動與肌凝蛋白是否也會產生動態變化? 其模式如何? 再者, 與細胞收縮蛋白息息相關的 RhoA 或 ROCK 訊息傳導, 是否也會受到影響? 畢竟RhoA 這個小的 guanosine triphosphatase, 過去的研究已知會調整細胞型態 (cell morphology), 導致細胞肥大或縮小, 並會影響 actin stress fibers, myofibril assembly, cell adhesion 以及 cytokinesis. 所以, 我合併將肌肉結構蛋白與RhoA納入去神經化後續結構影響的探討.

 整合素alpha7蛋白質表現的動態時間變化如左圖所示, 以GAPDH做為內部控制, 在去神經化週數 (postdenervation in week (PIW))表現是第8週表現最高(p<0.01), 然後逐漸下降, 但是即便是PIW26 仍舊維持在控制線之上, 這和mRNA的表現一致.

整合素其下游訊息傳導分子(integrin downstream signaling molecules)也呈現和整合素一樣的同時性(coherent)改變, 換言之, 第8週(PIW8)最高, 然後再下降. Ras, p-c-Raf, 和 p-ERK 1/2 蛋白質表現在第8週(PIW8)時, 分別比起對照正常組為 205.8-, 15.9-, 和 49.9-倍的上升 (p<0.01).


 前脛骨肌整合素螢光組織化學染色 (Immunohistochemical stains): 正常肌肉呈現中等的染色強度. 然而 去神經化骨骼肌在 PIW 8呈現最強的染色, 但是PIW 20 就減弱. PIW8的肌肉纖維外型是因為初期崩解而形成"聯合"一塊的模樣(confluent), 到了PIW20則肌纖維就崩解非常嚴重.  

MHC II 和 beta actin 也是在 PIW 8分別呈現4.569.6倍的上升(對照正常組), 然後在 PIW 26分別下降至1.9- 與 8.5-倍; Rho A 則於PIW8呈現驚人的 1490-倍增加.  

當組織和環境攸關的分子與其下游相關訊息傳導反應改變時, 組織形狀會跟著連動. 表面電子顯微鏡(SEM)的實驗結果: 去神經化肌肉表面損害隨時間顯現不同程度上的改變. PIW 8 的肌纖維表面呈現出最複雜的表面複雜度, 具有許多皺摺與凹陷, 甚至這些凹陷還匯合成較大的坑洞. 不過, 肌纖維表面紋理接著隨時間逐漸變成光滑, 逐漸崩解, 尤其是PIW26. 我把表面電子顯微鏡得到的各時間點肌纖維表面複雜度(surface complexities)量化數據和相對的整合素alpha7表現量做統計相關分析, 相關係數correlation coefficient, r= 0.873, 也就是高度相關連動.




 alpha7beta1 整合素已經被認為是 骨骼肌與心肌 肌原細胞(myoblasts)上的 laminin receptor. 除了整合素之外, 與整合素有關聯的 Ras, Raf, ERK1/2 在文獻上, 也已經被證實和許多生理過程息息相關, 如細胞增生, 分化, 發炎, 細胞凋亡, 肥厚等. 所以本研究證實, 既然整合素與其下游的訊息傳導分子 都和同一類生物現象相關, 自然應該在同一時間點一起改變, 也就是同時性. 只不過, 這些下游訊息傳導分子的表現倍數都不盡相同, 其原因在於這些下游訊息傳導分子大多"身兼數職", 與各式各樣的其他訊息路徑有所關聯, 也就是每一個訊息傳導分子分散在各訊息路徑的角色輕重不同, 所以倍數就會不同.

  總之, 生物現象都是動態變化, 整合素的結果與之前肉毒桿菌素和切神經論文, 都得到同一機轉的崩解狀態(去神經化), 會產生相同的同時性與雙相性變化模式(coherent and biphasic pattern). 首先, 邏輯分析上, 既然整合素與存活, 增生, 分化有關, 自然整合素也會和存活, 細胞凋亡路徑有統計相關的時序連動--同時性模式. 同時性模式的原因是因為自然系統如同量子糾纏的物理學原理一樣, 許多複雜系統都是互相糾葛的(entangled networks), 所以一個表面蛋白受到影響改變時, 其鄰近, 下游或是最高度相關的訊息傳導, 也會連動"同時", "近乎同時"或是"短的時間間隔內"改變.

  第二, 雙相性變化模式異於傳統二分法論點, (也就是分子生物表現單純上升或下降 (monotonically increasing or decreasing linear expressions)), 雙相模式就是在時間序變化, 同時兼具上升與下降的特色: 一開始先上升, 後來下降的趨勢. 過去去神經化文獻無法觀察到雙相性的原因在於, 實驗設計過於短期, 因此只看到整體變化的片段. 本研究設計長達半年至一年, 自然會得到較客觀的數據變化結論. 傳統對於雙相性的詮釋是認為: 生物體對於外部刺激傷害的代償反應(compensation), 為了組織存活而增加存活, 減少細胞凋亡訊息傳導來對抗細胞傷害的死亡攻擊. 雙相性模式, 甚至多相性模式的重要在於讓研究者了解, 臨床上只靠單一取樣的實驗設計, 會呈現截然不同的論文研究結果. 例如 雙相性模式如果選擇在時間前期取樣的文獻, 會得到"增加"的結果, 但是在時間後期取樣的另一文獻卻可能得到相反的"下降"結果, 接著, 就會有文獻總結時歸納出矛盾 controversy 的結論. 這是時間序對於科學研究產生的影響 (scale與sampling). 尤其是人類組織檢體(specimen)大多不知道時間, 也就是不知道疾病何時發生, 如癌症, 因此[後設邏輯]無法推估時間的情況下, 就會產生錯誤推論(inference). 這兩篇論文得到崩解狀態的組織呈現雙相性模式: 狀態的開始與結束, 其表面蛋白(整合素)與其下游傳導訊息分子, 存活, 細胞凋亡與表面構造複雜度都呈現低的表現, 中間因為代償機制上升到高峰, 儘管達到高峰的時間點有所不同.

  第三, 同一機轉的崩解狀態, 會得到類似的模式, 即便本研究不同方法的去神經化 (肉毒桿菌素是藉藥物去神經(chemodenervation); 而切神經則是直接切斷神經), 也不例外. 補充資料, 我針對藥物去神經化(chemodenervation)對不同藥物與不同組織做了實驗, 發現都會產生相同的雙相表現模式. 我用藥物抑制不同內臟的 副交感神經系統 (parasympathetic nervous system), 例如 腸胃道用Buscopan (antimuscarinics, M3) 與 心臟 用 Atenolol (Tenormin-- a selective β1 receptor antagonist, M2) 來去神經化, 然後分別檢查大腸(colon)與心臟(heart)的整合素與表面構造複雜度, 在一個月, 三個月與半年的變化, 驚人地發現也和肉毒桿菌素有一樣的同時與雙相模式.  
  
  第四, 觀察生物現象最佳的方式就是發現原則與模式. 肌纖維整合素表現量與肌纖維表面複雜度有統計相關, 換句話說, 整合素表現量高, 肌肉表面複雜度也高, 反之亦然, 這是整合素與表面複雜度的模式. 再者, 其是否可以衍生至其他組織呢? 我根據上述模式預測: 光滑的組織其整合素表現量應該會非常低. 因此利用人體腫瘤中非常光滑的子宮肌瘤來驗證此假說, 發現隨著子宮肌瘤越大, 表面電子顯微鏡(SEM)結果呈現越是光滑, 其整合素alpha v的表現量越是趨近一個非常低的表現量, 也就是趨近一個常數值 (mRNA= 0.39+/-0.06; protein= 0.47+/-0.08). 整合素的子宮肌瘤螢光染色也證實這個結果. 這個結果已發表於國際期刊 Gynecologic and Obstetric Investigation 2010.  以子宮肌瘤為實驗材料, 主要是因為子宮肌瘤的主成分是細胞間質(extracellular matrix, ECM) 增生, 所以更利於探討和細胞間質密切相關的整合素蛋白與表面構造的關聯. 子宮肌瘤細胞間質成分富含collagen, fibronectin, proteoglycan, 其膠原蛋白的排列紊亂, 很像蟹足腫的情況. 臨床上, 人體有些腫瘤無論生長得多大, 都維持良性腫瘤(benign tumor)的特性, 也就是異於惡性腫瘤(malignant tumor or cancer)會侵犯(invasion), 會轉移(metastasis)的特性. 這是非常令人困惑的自然現象!! 畢竟譬如癌症, 當癌症大小(size)越大, 一般其惡性程度與分期(staging)會呈現正相關. 我根據前述兩篇論文的結果: 整合素 和 存活 細胞凋亡訊息相關, 所以, 邏輯推理, 低的整合素表現, 預測其具有低存活訊息表現. 這意味著子宮肌瘤無論如何巨大, 都是良性的腫瘤行為, 和低存活訊息似乎有關. 至於其更廣的應用, 未來本研究可以衍生至更廣泛的生物現象探討(如癌症), 模式方便於模型的建立, 甚至治療的研發.

 
論文主體:
英文摘要:
Background:
Peripheral nerve injury causes serious problems in orthopedic and plastic surgeries. Cell adhesion molecules such as integrin alpha-7 provoke cell binding and signaling pathways within myofibers. Expression profiles of integrin alpha-7 signaling pathways and the molecule’s microscopic structure were assessed to investigate the long-term dynamic changes in denervated rat skeletal muscle.
Methods: A denervated rat skeletal muscle model was established by
severing the sciatic nerve for 1 week, 2 weeks, 4 weeks, 8 weeks, 12
weeks, 20 weeks, and 26 weeks. Molecular expressions were investigated by mRNA and Western blot. The structural alterations were detected by immunohistochemistry, scanning electron microscopy, and transmission electron microscopy.
Results: The denervated muscle atrophy presented the following dynamic molecular alterations: an initial increase around postdenervation in week (PIW) 8 and then a subsequent decay of integrin alpha-7, integrin downstream signaling pathway (Ras or Raf or, ERK1/2), Akt, cleaved caspase-3, fast myosin heavy chain (MHC),  actin, and RhoA. We demonstrated that the expressions of multiple signaling molecules were highly upregulated at PIW 8 (p<0.01). Scanning electron microscopy findings of the surface textures of myofibers showed more severe damage at PIW 8 and subsequently became smoother. Inner structures of myofibers separated with discontinuity on transmission electron microscopy examinations.
Conclusion: Our novel finding showed that time-series alterations of integrin alpha-7 signaling molecules and surface microstructures in the long-term denervated rat skeletal muscle are biphasic and coherently dynamic. Persisted p-Akt elevation suggested that denervated muscle may regenerate if reinnervation or other treatment was performed

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