漫談肌肉研究 Myology (1)
作者: 蔡豐州醫師 (版權所有, 翻印必究)
<前言>: 想提筆寫我研究最愛的肌肉, 一直找藉口沒時間, 沒能力, 畢竟收集和考據資料真的蠻花時間與精力的. 近來終於"時間管理"與決心更佳了, 因此, 不囉唆, 我就開始"陸續"慢慢寫這個長篇, 斷續與修改之處煩請見諒!
關於肌肉收縮自古有很多說法. 希波克拉底(Hippocrates)由於把長相同樣都是白色的組織: 肌鍵(tendon)與神經(nerve)弄混了, 所以認為是肌鍵是身體移動的關鍵. 後來, 亞里斯多德(Aristotle)比較了玩偶傀儡的活動方式, 主觀推理認為動物應該也差不多, 因此也贊同肌鍵就像繩索一般, 可以牽動人體的活動.
這兩位哲學家都斷定肌鍵是主角, 其實合乎應用科學的推理習慣, 觀察的切入點不同罷了. 只不過肌鍵其實是連結構造, 並非使肌肉收縮的主動構造. 這是很奇怪的歷史現象, 因為肌肉明明在人體組織裡, 佔得比例這麼多, 還是顯而易見的構造, 研究卻一直遇到瓶頸和誤解.
西元前3世紀 Erasistratus 提出一種說法: 動物的靈魂(spirits)會從頭部經由神經通到肌肉, 而神經是中空的管子, 藉由像加油一樣, 由神經這條管子灌進去肌肉叫做pneuma的物質, 所以肌肉會脹大, 縮短, 然後拉動關節.
應用科學常常引用日常生活的想法, 一個東西會變大, "想也知道"一定有東西灌進去, 像風啦, 水啦等等.
西元129年, 希臘學者 Galen 把這個說法也引用於他的解剖與生理理論裏, 而且影響了往後至少1500年之久, 包括 William Harvey (1578-1657)也在他的研究裏主張相似的觀點.
 哲學家 笛卡爾 (Rene Descartes, 1596-1650) 儘管不是那麼在行實驗與生物, 生理學, 他死後還是出版了一本關於人體生理的書 De Homine (1662), 書中還利用"靈魂"來解釋當人用手碰到火時, 反射動作為什麼會產生.
很不錯的假說?! 但是肌肉收縮, 體積真的會變大嗎? 我即使是個醫師, 到做基礎研究之後才知道: 其實並不會. 肌肉一收縮, 看起來鼓鼓的, 並不代表體積會改變, 那都是眼睛與刻板印象的邏輯騙了我們.
以現在的觀點來看上述的歷史, 會覺得"見鬼了". 不過科學的發展過程, 總會以當時合理的說法來解釋, 就像現在的物理學家認為光速是常數, 但是真的是這樣嗎??
 而且多早之前人類就知道了呢? 根據科學考據, 早在 西元1660年左右, Jan Jacob Swammerdam就利用把青蛙的肌肉封在密閉的充氣瓶中, 兩頭連著瓶子前後, 保留的神經露在外面, 然後刺激神經. 如果肌肉收縮時, 體積會增加, 瓶子上頭連著的水柱就會上移. 實驗結果出爐: 並沒有, 這可是歷史上第一個證明肌肉收縮體積沒有改變的人. 後來西元1677年 Francis Glisson 作了人類肌肉的實驗, 得到相同的結果 (他把手臂封在灌滿水的管子裏作實驗). 這個結果, 我四年前從文獻中知道的時候, 頗為震驚, 因為和我研究的肌肉數學公式有極大佐證之用.
 知名度被低估的17世紀科學家 Jan Jacbz Swammerdam, 不僅是最早利用顯微鏡觀察研究昆蟲等生物, 出過一本當時可說是科學"聖經"的書<The Book of Nature>, 還是第一個敘述紅血球; 更正蜜蜂是蜂后, 非蜂王主導的人; 也提出神經肌肉的嶄新假說.
同時期的另一位科學家 Niel Stensen 發現 pennate 型態的肌肉收縮時, 為了配合截面積改變, 肌肉的角度會改變, 是從幾何學角度的研究. 當他旅行至Leiden University 時, 輾轉知道 Jan Jacbz Swammerdam上述的實驗結果, 因為志同道合, 後來成為好朋友. 當然這對難兄難弟的結論, 衝擊當時科學界的主流(肌肉收縮必定有物質進入), 因此備受打壓, 甚至連歷史都沒記上幾筆.
唉! 科學自古皆是如此, 重要發現的定義似乎是一開始都是被視為異端.
上述看似粗糙的實驗與研究之後, 就沒有其他令人驚喜突出的肌肉收縮研究成果. 這類"大方向"肌肉收縮的研究, 那麼自然有人遲早會對"小地方"下手, 試圖尋找肌肉收縮的關鍵蛋白 或 物質. 肌肉收縮的重要蛋白質一直沒被真正發現或研究, 直到1864年由Kuhne這位科學家, 首度由高鹽度溶液中萃取出黏性的肌肉物質, 他稱呼它為myosin(肌凝蛋白), 並認為其是肌肉變硬(rigor)的根源. 接著由於實驗技術的限制, 科學的進展就此打住, 原地踏步蠻久的時間. 直到橫跨輝煌的19世紀末與20世紀初, 基礎科學屢屢突破人類的想像與極限, 肌肉的動力研究(Muscle mechanics)直到生理, 數學, 物理化學與分子生物學有長足進展之後, 才有了較突破的發現.
 肌肉研究的學者, 往往伴隨著神經生理的研究. 闡述這段歷史, 其實很難切割兩者, 尤其是20世紀初的許多科學家都是同時跨領域研究. 肌肉的分子構造在研究更清楚之前或同時, 有一部分研究專著於肌肉產熱和能量的關係. 英國生理學家 Archibald V. Hill 和 德國生理化學家 Otto Fitz Meyerhof 就是於第一次世界大戰時期, 對於肌肉與熱, 能量的機制研究, 幫助人類了解肌肉代謝, 尤其是乳酸循環, 後來一同得到1922年諾貝爾醫學獎.
 Archibald V. Hill--- 這張照片是典型科學家中的帥哥類型(即使已經年長): 堅定深沉 + 聰明慧詰 + 五官俊朗, 和一般現代目前流行的YA偶像純粹只有俊美的類型截然不同. 他早期是研究數學出身, 因此影響他後來的研究都會加入數學物理的模型建立, 因此被視為Biophysics 的宗師與開創者. 關於他所建立的機械模型, 稍後我會再提到. 他在諾貝爾得獎lecture中有一段話, 我覺得是非常重要的研究思考邏輯: [One of the fundamental characteristics of striated muscle, and the one involving the greatest difficulty in investigation, is the great rapidity with which changes take place in it. ..........The instantaneous and contemporary study of the events occurring inside the muscle fibre appears to be possible only in two ways, the mechanical and thermal. ] 科學家的思路必須非常清晰, 了解研究的困難, 目前的極限與限制, 然後尋找可行的方法加以突破. 回到肌肉分子研究上頭. Kuhne所討論的那一坨物質是什麼碗膏? 特性是什麼? 就等到 1930年 Muralt 和 Edsall 研究發現這個所謂myosin 的東西具有雙折射性質(flow birefrigence), 而且這類物質不管在大小與形狀上具一致性.
1935年 Weber 發展出新技術(稱為 H.H. Weber's method), 可以 in vitro 在試管中直接觀察研究肌肉收縮. 他把myosin先溶解於高鹽溶液(high salt), 再噴射squirt至水中, 如此myosin不僅形成 threads 的樣子, 也比乾燥的時候具有更強的雙折射性質.
目前現代食品加工分類上, 肌肉蛋白質根據溶解性質, 可以分成三類: 水溶性(30%), 鹽溶性(50%), 不溶性(20%, 多是結締組織). 所謂的[鹽溶性蛋白質], 其顧名思義是微溶於水, 但是大部份溶於鹽溶液的蛋白質.
肌肉收縮勢必需要大量的能量, 那麼生物已知的能量來源來自哪裡? 合理的推測就是ATP. 早在1934年 Lohmann 就已作如是的推理, 但是科學可不能說了算, 因此直到1939年 Engelhardt 和 Lyubimova 才由實驗發現一個myosin的重要性質, 也就是它具有ATPase的活性---- 這是合理的假說推論所導致的實驗成果.
但是大家都相信這個結果嗎? 可不一定是. 因為那個年代普遍認為酵素(enzyme)應該長得像globular 的形狀, 但是myosin 偏偏不是, 而且陸續有些學者(如 Polis 和 Meyerhof (1941年)) 想要分離出ATPase, 卻始終失敗. 所以 一群人狐疑了許久!!
上述這個年代的學者, 其實大部分處於戰亂, 紛爭不斷的艱困歲月, 因此研究特別困難 尤其是實驗的部分. 您如果上網查諾貝爾獎一些得主的成長背景, 有些真的是歷經滄桑, 離鄉背井..., 都可以拍成富戲劇性的電影, 甚至克服生命的威脅, 才成就學術的偉大.
 Albert Szent-Gyorgyi 就是在戰爭時期, 完成諸多重要的肌肉實驗與發現. 他是匈牙利人, 第二次世界大戰時, 為了躲避納粹秘密警察GESTAPO, 這個曾經一度覺得可能活不過明天的人, 還逃難到瑞典當公民. 戰亂的當口, 許多科學家在資訊完全封鎖封閉的情況下, 依舊秉持著驚人的毅力, 完成許多研究. 所以有些研究往往是先後, 甚至同時"不約而同"發現, 戰爭阻斷交流, 論文紙本期刊又不見得看得到, 容易在彼此毫不知情的時空下, 得到"英雄所見略同"的結論. 每次寫到西方國家這類故事, 我心裡都會想: 是什麼樣的文化高度萃取出如此理性思維的人種? 如此執著於科學?
他在故鄉的Institute of Medical Chemistry University Szeged, 用出版集結成書的形式, 發表關於肌肉收縮等研究共三册(1941 to 1943), 可不是三篇文章喔. 現在的學者會問: [這麼好的研究怎麼不投稿 Nature, Science?] 別傻了, 怎麼投, 空投? 還是用飛彈投稿嗎? 每當有人問怎麼樣才算是對科學有興趣, 我都會舉一大堆這類例子來形容.
科學的發表往往受限於各種因素, 上述是時空, 千辛萬苦, 不過還有其他千奇百怪的軼聞, 如 著名的機率理論 T分布, 是1908年 WS Gosset 第一次發表在論文中. 但是當時他受雇於愛爾蘭的一間釀酒廠, 合約規定不准其員工將研究成果發表, 所以Gosset只好以[Student]的化名發表他的成果, 因此後來T分布就經常被另稱為[Student t-distribution]. 很多做研究一輩子, 尤其是醫學生物統計用到翻掉, 都不知道這個典故.
 匈牙利(Hungary) --- 一個被稱為20世紀量產最多天才的地方, 還曾被懷疑怎麼地球上有這麼個國家, ㄧ次出現這麼多驚人的天才? 所以普林斯頓高等學院裡的人"合理"高度懷疑/戲稱這批匈牙利人是"火星人".
舉例: 首推歷史上 "真正的"全方位天才狀元<跟他比, 大多數的績優/資優嚴格說來都是後天努力居多>-- John von Neumann (賽局理論, 電腦的發明者, 量子力學數學理論奠基者, 集合論, 運算元, 數值分析, 本文之後提到的"蒙地卡羅數值分析法則(Monte Carlo method)"開創者..... (頭銜一堆)...具圖像式超人般的記憶, 心算, "外星人"般的理解力. 小時候現場背電話簿內容娛樂給親戚朋友看; 8歲懂得微積分; 許多著作如<<雙城記>>, 他可以幾年前讀過之後, 臨時考他, 還是可以背誦出指定頁數的所有細節, 直到你受不了為止; 和他專業差很遠的的論述, 他翻幾下就可以找出錯誤與修正;....); 大數學家 Polya 曾經這樣描述 Von Neumann: [他是唯一讓我感到害怕的學生. 在課堂如果我提出一個當時未解的問題, 通常他在下課後就會直接來找我, 給我幾頁完整的解答.];... 其他其他"戰鬥力"弱一點"火星人"還有: 數學家 Paul Erdos; 物理學家 Eugene Wigner, ...等等).
匈牙利是量產富教育文化薰陶的天才產物, 這也是20 to 21世紀的主要模式, 但是歷史上還有另一種: 窮困潦倒落後的國家所生產類似"異形"的人類, 印度數學天才Srinivasa Ramanujan就是, 你可以想像在19世紀末, 印度極為貧窮的鄉下Erode, 這個人看過ㄧ本書自修(Synopsis of elementary results in pure mathematics), 深受啟發, 就可以憑著自己的天賦, 推導出一些數學原理嗎? 他後來自稱這是印度神衹在跟他說話.
Albert Szent-Gyorgyi 於1942年利用簡單的設備, 如 Ostwald viscometer, polarizing filter等, 發現: 將肌肉置於高鹽溶液 二十分鐘後, 可以找到低viscosity的蛋白質, 命名為myosin A. 但是過夜之後, 卻可以發現另一種高粘度的蛋白, 命名為myosin B.
 Ostwald viscometer  P 為毛細管兩端壓力降, Dp為毛細管直徑, L 為毛細管長度, Q 為流體體積流量 myosin B 加了ATP之後, 粘度下降, 但是myosin A 卻不受影響. 這個結果也於1942年被 Needham 等科學家同時發現, 他們觀察到ATP可以降低粘度與雙折射性, 這個改變可以當ATP被消耗之後, 又恢復原貌.
 Szent-Gyorgyi 再用H.H. Weber's method做實驗, 發現myosin B 加入煮沸的肌肉"汁"之後, 居然會收縮(如圖B所示), 但是myosin A則不會(如圖A所示). 進一步分析煮沸肌肉汁的活性物質, 發現其內含ATP. Szent-Gyorgyi 於1963年回憶當時看到上述的線狀物質會收縮的景象時, 他驚呼: [這簡直是我這輩子最 thrilling moment. ]
研究做到會戰慄發抖興奮, 是每個科學人的夢幻經驗!!
他講過許多深得我心的話, 如 [It is easy to find good scientists, because the good scientists are mostly those who have produced good science. Find them and support them, enable them to work. That's all there is to it. Don't torture them with senseless projects.]; [A discovery is said to be an accident meeting a prepared mind.]....
Straub 後來加入他的團隊, 逐步釐清與純化出另一種關鍵蛋白: actin(肌動蛋白), 後面會提到. myosin A 先於1943年純化為Paracrystals, 維持一樣的名稱是myosin; 但是, myosin B 則被更名為 actomyosin. Straub 發現actin存在兩種不同的形式: 一是 globular actin (G-actin), 它於缺乏鹽份時, 仍保持穩定; 另一是 fibrous actin (F-actin), 此種蛋白只有存在於離子(ions)時, 才會聚合(polymerize).
接著一連串獨立, 讓人眼花撩亂的實驗結果, 都逐步朝向讓myosin與actin之間關係更加明朗. 譬如:
@Banga發現actomyosin會被鎂離子活化.
@Actomyosin加入ATP之後會迅速沉澱, 稱作"Superprecipitation", 也就是觀察起來似肌肉收縮. 這個現象反過來思考, 當缺乏ATP時, 肌肉不收縮, 沒活性, 就會呈現rigor狀態. 換句話說, 現在電視影集看到的屍僵(rigor mortis)現象, 就是肌肉失去ATP之後, 僵硬的原因 (Erdos, 1943).
@Szent-Gyorgyi 團隊的 Guba 發現ATP有兩種取決於離子強度的功能: 低離子強度時, ATP會使肌肉收縮; 高離子強度時則會讓actin與myosin分開(dissociate).
...............
但是誠如所有科學實驗面臨的問題, 有些人不太相信: 這種看到一條線 或是 沉澱, 就代表肌肉收縮嗎? 也就是說這種實驗模型成立嗎? 會不會都是自己看爽的, 圖變短就代表收縮? 實際活體是不是這麼一回事? 比如說 Astbury 和 Meyerhof 就認為超級沉澱現象, 可能是artifact. 畢竟實驗看到沉澱是很普通的, 您喝湯, 吃火鍋, 鍋底是不太被重視的. 這些人要其他科學家買單點頭, 得提出其他證據.
有趣的是, Astbury和Szent-Gyorgyi 還是極好的朋友, 可見科學是不論交情的, 事實就是事實, 可不能妥協, 套交情, 串通, XX%X#. 要說服他, 得再拿出真功夫, 好料的主菜.
所以Szent-Gyorgyi 於1949年, 發展出一種用glycerol製備肌肉的技術, 其經過改良後, 到目前還廣為使用, 稱為glycerinated muscle preparation, 這個技術的優點是經過此種製備的肌肉, 仍然可以讓離子進入穿透. 因此加入Mg++ATP 的肌肉, 仍然會產生張力(tension).
幫您回憶一下, 也就是說之前做實驗都是萃取提煉xxx, 而不是一整塊, 直到現在終於可以搞大一點, 試試模擬接近真的情況. 另外, 科學家的研究過程都是像解謎一般, 每次能不能挖到寶, 是不是拿到真正的那一塊關鍵拼圖, 沒人有把握. 因此, 您不可以將現在書本上的已知知識 套過去研究的經歷與歷史, 會老覺得兜不起來, 怪怪的. 譬如說, 這一段肌肉歷史, 都是把想要理解的那一段構造, 分解, 然後個別命名, 每個科學家分解的部位也不同, 所以會容易被搞亂, 當然也和現在已知的名稱/術語不同.
好了, 到目前為止, 或許被說服與否, 仍不知道. 但是至少科學在這一連串的努力下, 建立了一種模式, 也就是在in vitro情況下, 操作actin與myosin兩種蛋白來了解肌肉收縮, 算是開啟了現代 muscle biochemistry 的先河.
1963年, Hanson 和 Lowy 以及 Huxley, 分別分析出一個結論: 大約400個myosin分子會組成filament, 然後與大約數目的actin monomer產生交互作用. Myosin至此有幾種功能被找到: filament formation + ATPase activity + reversible combination with actin.
接下來用到的方法, 就是科學家開始使用酵素(proteolytic enzyme)來切斷分解所要了解的蛋白質, 也就是分段了解其中的結構與功能, 更細的了解.
首先, 用trypsin或chymotrypsin來分解myosin, 其在含有Ca和Mg離子的0.6M KCl溶液中, 可以發現兩種不同沉澱速度的部份, 在圖上呈現雙峰, 並且加入actin之後, 快速沉澱的component會沉澱更快, 代表它會和actin結合. 接著命名它們, 較慢的分子片段名稱為 LMM(light meromyosin) , 較快的部份命名為HMM(heavy meromyosin) . HMM和LMM的溶解度差別如下: 低離子濃度下, HMM可溶, LMM結晶; 或者 LMM在下述條件會沉澱, <0.2M KCl, 30% ammonium sulfate.
 我們來顛倒ㄧ下歷史, 左圖是像先偷看考試答案一樣, myosin截至目前為止的構造結論圖. 看了答案 然後幫助我們了解前人研究的過程, 才不會搞混!!
前面已經講過酵素加進去可以分解蛋白質, 然後科學家就像鍊金術士, 得嘗試各種條件來切出不同的分子片段出來.
因此, 邏輯上, 改變分解條件時, 會產生不同的結果, 所以純粹看誰實驗的運氣好 / 天份高, 譬如說: 目前的作法是去除二價金屬離子, 且在0.1M KCl的條件下, 可以切斷Myosin其雙頭部位, 形成2個 S1 (Subfragment 1, 分子量9.5kDa) 和 Rod (分子量22kDa) 部分. 然後 rod 再放入二價金屬離子的0.6M KCl 溶液中, 又可以將 S2 與 LMM分開.
得到上圖的精細結構的結論前, 科學家亦是抽絲剝繭, 逐步得到ㄧ個個不完整的發現: 1962年 Muller 和 Perry 讓HMM曝露在trypsin的時間長一點, 會使得它斷裂成兩塊, S1 和S2. 隨著電子顯微鏡的進步, 1967年Slayter 和 Lowey 觀察到 myosin有兩個頭----- 這個觀察邏輯上, 科學家一定會猜, 就像線有兩股, 或許myosin是由兩條parallel peptide chains組成. 上述邏輯猜想很奇怪: 難道不會有雙頭蛇嗎? 1969年 Lowey 再接再厲, 在低離子濃度時, 用papain和 chymotrypsin 將myosin分解成S1和rod. 稍後1978年Sutoh將S2分離出來, 同時發現其可以 flexible.
前面提到過actin被Straub於1942年發現之後, 陸續研究出, 當其於缺乏鹽類的情況下是單體, 稱為G-actin; 但是鹽類出現的時候, 特別是divalent cations, actin會聚合, 此種高度不對稱的聚合物, 稱為F-actin, 其具有高黏性, 強double refraction特性. 不過製備actin有一定難度 因為以前F-actin只要從肌肉中被萃取出來, 都是伴隨myosin, 而且ATP都被hydrolyze.
我們想要從新鮮肌肉組織去除myosin, 同時保有ATP, 怎麼做呢? 目前是用acetone來denature myosin, 然後再用弱鹼無鹽溶液 將actin, 去聚合物化depolymerize, 並萃取出. 1963年 Hanson and Lowey, 發現actin在鹽類存在時, 聚合成 長雙股螺旋具週期性(約360A).
研究寫到這裡, 結構各個部份釐清之後, 似乎LMM負責filament的核心部份, 但是S2讓myosin的頭可以彎曲, 得以搆到actin. 由科學研究常見的歷程來看, 結構一旦比較清楚之後, 科學家就會有人開始猜肌肉收縮的動力模型到底是怎麼一回事? 結構怎麼移動會有功能? 這也是基於分子生物研究的實驗基礎之後, 數學與物理跨領域合作的一種典範. 果不其然, 這些結果就幫1963年之後 Huxley 的 cross-bridge cycle 理論奠基.
接下來的內容請參閱 第二單元: 漫談肌肉 Myology (2)
Reference:
@ Denoth J., Telley IA. Sarcomere dynamics during muscular contraction and their implications to muscle function J Muscle Res Cell Motil 28:89-104;2007
@ Cobb M. Exorcizing the animal spirits: Jan Swammerdam on nerve function Nature 3:395-400;2002
@ Andrew G. Szent-Gyorgyi Milestone in Physiology: The Early History of Biochemistry of Muscle Contraction J Gen Physiol 123:631-639;2004
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漫談肌肉研究 Myology (1)
蔡豐州醫師
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